### 试剂解冻与混匀

1）从冰箱中取出试剂；
2）缓慢进行解冻；
3）轻轻颠倒混匀以确保充分混合；
4）低速离心处理以去除气泡。
提示：在混匀时应尽量避免气泡的产生，因为气泡可能会影响酶的活性或实验结果的准确性。

### 稀释步骤

1）如果需要追踪模板，请按照以下步骤进行稀释；
2）如无须追踪模板，可以直接用无菌超纯水稀释cDNA，或者直接使用cDNA原液。常用的荧光定量仪器为96孔反应，通常配置为12列×8行。

#### 示例配置说明

1）对于大体系的配制，单孔量建议为：
- HieffUNICON® ColorGPSqPCRMasterMix 10μL；
根据孔数n选择n+1或n+2的总量（每孔18μL），配制一个大体系。
- 正向引物（10μM） 0.4μL；
- 反向引物（10μM） 0.4μL；
- RNase-free H2O 72μL。

例如，若检测基因1的样本，单孔量配置为(22孔量)：
- HieffUNICON® ColorGPSqPCRMasterMix 10μL；
- 正向引物（10μM） 0.4μL × 22；
- 反向引物（10μM） 0.4μL × 22；
- RNase-free H2O 72μL × 22。

将上述溶液依次加入后，将管盖严密，轻弹管壁使各组分充分混合，然后放入小型离心机中短暂离心1-2秒。再次轻弹管壁以去除气泡后，再次轻微离心，并将其置于冰/冰板上。

#### 注意事项：

例如，若采用显踪剂，建议模板投入体积控制在2-5μL，以保证显踪效果。如使用cDNA母液，建议投入体积控制在2μL（反应体系的1/10）以内，以防影响扩增效果。

### 上样体系配置

基因1的检测步骤为1）配置大体系Mix 18μL；
然后加入cDNA模板2μL。完成加样后，盖好管盖，轻轻弹管壁以确保各组分混合均匀，随后短暂离心1-2秒，确保无气泡后将其置于洁净的96孔PCR管架上。

#### 注意观察

需确保每次吸取过程中没有气泡产生，气泡吸取可能会导致实验数据出现较大偏差。

### 上机前检查

在上机之前，仔细检查管子，确认管盖、管身上无任何记号笔染料，管内无气泡且管壁无液体。若采用常规程序，请进行以下设置：

循环步骤：
- 预变性：95℃ 2分钟，循环1次；
- 变性：95℃ 10秒，循环40次；
- 退火/延伸：60℃（可根据引物TM值和目的基因长度调整）30秒；
- 熔解曲线阶段：根据仪器默认设置1进行。

### 快速程序设置

若采用快速程序，需确认仪器本身是否支持快速升温和降温，并进行相应设置。以ABIQ5为例：

循环步骤：
- 预变性：95℃ 30秒，循环1次；
- 变性：95℃ 3秒，循环40次；
- 退火/延伸：60℃（可根据引物TM值和目的基因长度调整）10秒；
- 熔解曲线阶段：根据仪器默认设置1进行。

得到的Excel数据处理可参照仪器品牌及型号，如：Bio-Rad、Roche、ABI等，推荐使用MILE米乐的高灵敏显色示踪荧光定量预混液（Cat#11188ES），其能够提升实验的敏感性与特异性，助力实验结果的准确性。