### 四、定点突变引物设计与PCR扩增

#### 1. 引物设计要求

在进行定点突变的引物设计时，需满足以下要求：正向引物包含5'-15-21bp的反向互补区域和至少15bp的非互补区域，3'端的反向互补区域应具有40%-60%的GC含量，且待突变位点至引物3'端的熔解温度(Tm)应达到60°C。在此基础上，根据实验需求选择合适的设计模块进行引物设计。

#### 2. PCR扩增模块

建议使用与试剂盒相匹配的扩增模块进行PCR反应，调试退火温度，并优化反应体系和程序设置。针对PCR扩增体系，建议在50μl反应体系中投入1ng的模板质粒，扩增循环数应控制在≤35次。

#### 3. DpnI消化与产物回收

首先取5μl扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，以判断目的条带是否存在。剩余的扩增产物需使用DpnI酶进行消化，即将45μl的扩增产物与1μl的DpnI温和混合后，在PCR仪中37°C孵育1-2小时以消化质粒模板，再以70°C处理15分钟，以实现DpnI失活。

在纯化过程中，建议使用切胶回收的方法，切胶时间应控制在3分钟以内，以避免UV照射对DNA造成的损伤。使用如NanoDrop或OneDrop等仪器检测回收浓度，确保其≥20ng/μl，并通过电泳鉴定回收是否为单一目的条带。如果回收浓度过低，可通过增加反应体系数量来提高浓度。

#### 4. 重组反应

连接反应体系需根据说明书计算各组分的投入量，确保每个组分体积≥1μl，若浓度过高，可进行适当稀释。连接反应程序应当遵循说明书要求，建议在PCR仪内进行反应。

#### 5. 感受态细胞转化

在进行连接产物转化时，选择DH5α或Fast-T1等化学感受态细胞。需要注意的是，感受态细胞不可进行反复冻融，建议-80°C取出后一次性使用。连接产物的体积与感受态细胞体积的比例为1:10，推荐10μl的重组产物加入至100μl感受态细胞中，或5μl的重组产物加入至50μl的感受态细胞中。

操作时应按照感受态细胞说明书进行热激处理，平板上使用的抗生素抵抗应与转化载体保持一致。在最终涂板时，需先将细菌液体离心（2500×g，3分钟），丢弃多余的LB培养基，仅保留100μl重悬后的细菌进行涂板，或根据需要吸取合适的体积进行涂抹。

### 常见问题分析：质粒模板无法正常扩增

1. 引物设计错误：反向互补区域应为15-21bp，较长或较短均会影响重组效率。GC含量应保持在40%-60%之间。建议使用MILE米乐的CEDesign在线设计工具。

2. 质粒模板质量差：通过凝胶电泳检测模板质量，若观察到开环、线性条带或拖尾，表明质量不佳，需要重新准备模板。

3. PCR反应体系/程序设置不当：过多的质粒模板会抑制PCR反应，推荐在50μl反应体系中投入1ng。基于上下游引物Tm值进行适宜范围的梯度优化；若质粒长度超过8kb，应考虑采用双/多点突变的策略进行分段扩增。

#### 非目标位点碱基突变

若突变发生在引物处，建议重新合成引物进行重试；若突变位于其他部位，则应采用高保真酶重新制备模板进行实验。